使用方法：使用前经过清洁消毒，培养皿清洁与否对工作影响较大，可影响培养基的酸碱度，若有某些化学药品的存在，会抑制细菌生长。新购的培养皿应先用热水冲洗，再置于质量分数为1%或2%的盐酸溶液中浸泡数小时，使游离碱性物质除去，再用蒸馏水冲洗2次。若要培养细菌，再用高压蒸气（一般6.8*10的5次方Pa高压蒸气），120℃的温度下30min灭菌，置室温中干燥，或用干热灭菌，就是将培养皿置于烘箱内，温度控制在120℃左右的情况下维持2h，即可杀死细菌的胞牙。细过消毒的培养皿才能接种培养使用。
培养皿通常使用固体培养基制成平板培养（就是平板皿名称的由来），平板培养基制作是将已装好的灭菌琼脂培养基，用温水（无菌）溶化，取下试管棉花塞，管口于酒精灯火焰上通过，然后微启灭菌的培养皿盖，使试管口能深入为宜，倾入培养基后即可盖密，再轻轻地摇匀倾入的培养基，使之均匀地分布于皿底上凝结，即得平板培养基。由于细菌的繁殖、发育生长是与所供给的培养基（营养）有直接关系，尤其是作定量检验分析，对提供营养物的多少，有决定意义。细菌培养时对营养提供的多秒、是否均匀，培养皿皿底是否平整极为重要，如培养皿皿底不平，琼脂的培养基分布将随培养皿皿底是否平整有厚有薄，薄的部分营养供给就不足，这对定量分析有着密切关系，故对定量培养皿皿底要求特别平整拜原因所在。但作一般定性（检验细菌、菌落生长、繁殖等），使用普通培养皿即可。